异基因造血细胞移植（allo-HCT）是治疗多种血液系统恶性肿瘤和非血液系统疾病的重要选择。随着预处理方案、移植物宿主病（GvHD）预防和支持性护理的改进，移植相关死亡率得到有效降低，但血液肿瘤复发依然是allo-HCT后死亡的首要原因。对于复发的治疗，临床可选择的方式很多，包括免疫抑制剂减量、供体淋巴细胞输注、二次移植、去甲基化药物、检查点阻断剂，CAR-T等，但以上药物对于治疗复发的免疫学原理有所不同，对患者的特异性也有所差别。这就要求临床医生，理解复发的免疫学原理，这样才能更好的选择最为合适的治疗方式。
那么有些临床医生可能会问，移植前血液肿瘤治疗效果较好的治疗方式是否在移植后有同样的效果呢？我的复发治疗方案是否可以参考术前的治疗方案呢？为了回答这一问题，我们可以看一下以下两张利用单细胞测序分析血液肿瘤克隆演变的图。

如图所示，不同颜色代表不同的肿瘤克隆，图示面积越大，代表肿瘤克隆越多。从图中AML患者的肿瘤克隆变迁中，我们可以发现，经过化疗后，患者活下来的肿瘤细胞是此前含量最少的肿瘤细胞，而经过移植后，肿瘤克隆的类型也发生了完全的变化。

而上图的MDS患者的肿瘤变迁示意图中，血液肿瘤初发时，我们都可以通过各种技术获知肿瘤的成因，而患者经过化疗和移植后，活下来的肿瘤细胞基本都为未知驱动的（绿色），这类肿瘤细胞在初发时只占到原先肿瘤的一小部分。
以上两个单细胞测序得出的血液肿瘤变迁图表明，移植后复发的肿瘤克隆跟肿瘤初发时的克隆具有较大的差异（这个也是部分分子生物学MRD指标在移植后失效的主要原因），这一结果提示我们，移植后肿瘤复发的治疗方式跟肿瘤初发时是不通用的（肿瘤克隆不同），我们需要清楚知道患者的复发原理，才能更好的指导临床进行最优治疗。
下面，我们来跟大家介绍几种常见的移植后复发的免疫学原理和相关的诊疗。
HLA loss（HLA单倍体丢失）
HLA Loss发生的原理
HLA loss概念：一种免疫逃逸方式，HSCT后残留的白血病细胞可以通过基因组丢失不匹配的HLA单倍型来逃避同种异体供体T细胞的监控，并生长到临床复发。
以上文字可能比较生涩难懂，我再用图示跟大家解释一下HLA LOSS的发生原理。

Allo-HCT后白血病细胞的清除主要依赖于供体的T细胞和NK细胞，供体T细胞通过识别非己的HLA抗原起到GvL效应。患者的HLA分型为A1和A2（大家可以把A1和A2理解为是两条单倍体），供体为A2和A3（单倍体移植）。移植后供体的T细胞通过识别患者肿瘤细胞的非己抗原A1，发挥GvL效应，肿瘤细胞被大规模杀伤。但在某一天，某个肿瘤细胞染色体重排时发生了一些问题，编码A1的染色体被编码A2的染色体替代，这时肿瘤细胞的HLA表面抗原变为了A2，A2，而A2是供体细胞具有的HLA抗原，供体细胞不会对A2，A2的肿瘤细胞进行杀伤。这时，肿瘤细胞通过A1（单倍体）的丢失，逃脱了供体T细胞的攻击，形成了免疫逃逸。
达尔文进化论里‘适者生存’相信大家都知道。不是因为移植后GvL效应导致HLA Loss的发生。而是移植后，肿瘤细胞“刚好”发生突变，形成HLA Loss，而HLA Loss的发生有利于肿瘤细胞的生存，最终使肿瘤细胞因HLA Loss导致免疫逃逸，原理上是适者生存。我们再举个日常的例子，篮球运动员都长得比较高，但是没有科学证据表明打篮球本身可以增加身高，只是因为长得高的人，打篮球有竞争优势，能更好的在职业篮球圈中更好的“活下来”而已，这同样是适者生存。
HLA Loss的发生率

在单倍体移植中，患者肿瘤细胞的整个HLA单倍体都会被作为供体T细胞的攻击对象，其发生HLA单倍体丢失后，其获益最大，生存优势最明显，所以在单倍体移植中，HLA Loss最为常见，发生率约为29%。在不全相合的移植中，HLA Loss也会时有出现，供受体错配位点越多，HLA Loss发生的几率越高。而在脐血移植和全相合移植中，HLA Loss基本不会出现。
HLA Loss复发的时间及预后
前面我们已提到，供体T细胞GvL效应越强，HLA Loss发生的几率就越高。而移植后初期较好的GvL效应也代表着患者会在移植后短期内出现完全缓解。经过HLA Loss活下来的肿瘤细胞开始时可能只有1个，通过不断的分化，增殖，肿瘤细胞才慢慢增加（如图1，图2）。

图1

图2
所以，因为HLA Loss导致复发的患者，复发时间大多较晚（中位时间约为移植后307天），远晚于传统复发患者（中位时间约为移植后88天）。但由HLA Loss导致复发患者的整体存活率与传统复发相当。
HLA Loss的治疗

另外，有一个很重要的概念大家需要清楚了解的是，HLA LOSS只发生在肿瘤细胞，不会发生在患者正常细胞当中。供体淋巴细胞输注是移植后复发的重要治疗手段。但在因HLA Loss复发的患者当中，会怎样呢？接回此前的例子，患者HLA分型为A1，A2，患者移植前其肿瘤细胞及组织细胞均为A1，A2。移植后，患者发生了HLA Loss，此时患者的肿瘤细胞变为A2，A2而患者的组织细胞依然为A1，A2。如果此时我们采用供体淋巴输注，输注A2，A3的供体细胞，这些供体T细胞无法识别肿瘤细胞（肿瘤细胞表面的A2抗原为供体自身含有的），没有任何的GvL效应，但是这些供体细胞却能识别患者组织细胞的A1抗原，发生GvHD效应。所以，对于移植后明确发生HLA Loss的患者，进行DLIs是完全没有GvL效应，却显著增加GvHD风险的。
因HLA LOSS属于基因层面的丢失，对于HLA LOSS导致复发的患者，没有任何药物可以将HLA LOSS逆转，目前较好的治疗方式为二次移植。二次移植选择供体时，尽量选取与患者未丢失HLA单倍型错配的供体进行二次移植。如此前病例，选择供体时，可以选择A1和非A2的供体（半相合移植）进行移植，选择A1的目的是降低患者GvHD的复发风险，选择非A2的目的是让供体细胞能给识别肿瘤细胞的A2抗原进行攻击，发挥GvL效应。在这个原理下，孩子此前是父亲作为供体的，二次移植则可以选择母亲。

在一项纳入40名在2005年-2015年之间因HLA LOSS导致复发而进行二次移植患者的研究中发现，二次移植选择新单倍体移植的患者总体存活率显著高于采用相同供体的患者。
HLA II类抗原表达下调
此前，我们介绍了由HLA基因组丢失导致的免疫逃逸，这表明HLA在产生GvL效应中发挥了重要作用。那么除了基因组缺失，肿瘤细胞还会通过其他途径，利用HLA达成免疫逃逸呢？
由HLA II类抗原表达下调导致复发的发现

最近，发表在Natural Medicine的文章的研究，通过转录组测序分析了患者在移植后复发，化疗后复发，血液肿瘤确诊时的基因表达情况。研究表明，移植后复发患者，其肿瘤细胞HLA II类抗原表达情况都比化疗后复发或血液肿瘤初诊时有明显下调。

进一步通过分选出肿瘤细胞进行qPCR检测发现，移植后复发患者的HLA II类表达（HLA-DRB1、HLA-DQB1、HLA-DPB1）比移植前都存在显著条件，而化疗后复发患者的HLA II类抗原表达水平则无明显变化。
另外，通过流式检测也同样表明，移植后复发患者的HLA II类抗原总体表达量的MFI值显著低于其移植前检测。以上结果表明，肿瘤细胞HLA II类抗原表达下调同样是移植后免疫逃逸（复发）的机制之一，这一情况也说明供体CD4 T细胞（CD4 T细胞与HLA II类抗原结合）在GvL效应中发挥重要作用。
因HLA II类抗原表达下调导致的复发约占复发患者的40%。与HLA LOSS主要出现在半相合移植中不同，所有类型的移植均会出现HLA II类抗原表达下调。我们可以通过标准化的流式细胞术对肿瘤细胞的HLA II类抗原表达情况进行检测。
HLA II类表达下调的相关治疗
HLA LOSS是基因组水平的丢失，这个基因组的丢失是不可逆的。而HLA II类表达下调很多是转录水平或者是表观遗传学水平的，这提示我们其实有很多治疗方法可以对HLA II类表达下调进行逆转。
IFN-γ药物

此前的一些研究中，发现IFN-γ可以很好的诱导HLA表达。而在最近发表在NEW ENGLAND文章中的临床实验表明，移植后因HLA II类表达下调导致复发的患者，服用IFN-γ类药物72小时后，HLA II类表达水平有显著上升。
供体淋巴细胞输注（DLIs）

通过供体淋巴细胞输注，大量供体T细胞通过识别其他抗原（肿瘤细胞表面HLA I类抗原或健康组织抗原）可以诱导IFN-γ的分化，从而恢复HLA II类抗原的表达。如在最近发表的研究中发现，在AML小鼠中进行供体淋巴输注后，可以显著提高小鼠的IFN-γ水平，继而提高HLA-DR表达，增强GvL效果。
去甲基化药物

CIITA是HLA II类抗原表达的主要调控因子。CIITA表达受到影响也会显著降低HLA II类抗原的表达。

最近的研究表明，移植后复发患者的CIITA甲基化程度显著高于其移植前水平，从而导致CIITA表达下调，最终使HLA II类抗原表达下调。另一方面，同一患者化疗前后的CIITA甲基化程度及其表达量没有明显变化。以上研究表明，去甲基化药物，通过降低CIITA甲基化程度，可以逆转HLA II类抗原表达下调。

进一步的细胞学实验表明，通过地西他滨（去甲基化药物）或联合IFN-γ可以显著提高HLA-DR表达。
T细胞抑制性配体上调导致的复发

同一患者移植后复发与移植前肿瘤细胞转录组的大规模研究表明，HLA II类抗原在移植后有明显下调，而T细胞抑制性配体（如PD-L1、PD-L2）会在移植后复发时有所上调，这一结果表明，T细胞移植性配体上调可能也是移植后复发的其中一种方式。

肿瘤细胞中，表达的PD-L1会与T细胞中的PD-1结合，使T细胞功能无法正常运作，从而导致肿瘤的免疫逃逸。通过T细胞抑制性配体上调导致的复发约占复发患者的30%，且常与HLA表达下调同时出现。任何移植方式均会出现T细胞抑制性配体上调（半相合移植略高），相关检测跟HLA II类抗原表达下调相似，可以通过标准的流式细胞术对肿瘤细胞的PD-L1表达进行检测。
HLA II类抗原表达下调治疗与T细胞抑制性配体上调
此前，我们在聊HLA II类抗原表达下调时，通过IFN-γ或去甲基化药物可以很好的进行逆转。


但进一步的研究发现，IFN-γ和地西他滨在上调HLA II类抗原表达的同时，同样也会上调T细胞抑制性配体PD-L1、PD-L2。以上结果表明，在治疗HLA II类抗原表达下调导致复发时，也需避免患者的复发机制由HLA抗原表达下调转变为T细胞抑制性配体上调。
T细胞抑制性配体上调复发的治疗

T细胞抑制性配体上调是肿瘤发生的常见机制，目前已有多种相关药物上市。如最近一项纳入30名移植后复发的患者，服用PD-1阻断剂后（90%患者使用Nivolumab，10%患者使用Pembrolizumab），77%患者达到缓解（95%CI: 58%~90%）,其中15名患者达到完全缓解，8名患者部分缓解。另外，CTL4阻断剂伊匹单抗（Ipilimumab）同样对移植后复发具有较好的治疗效果。但在使用T细胞抑制性配体阻断剂后（特别是PD-1阻断剂），患者会显著增加GvHD风险，这一点临床也是需要特别注意的。
另外，此前国内一些中心采用地西他滨（去甲基化药物）作为治疗或预防复发用药时，效果欠佳。主要原因是地西他滨在降低患者由HLA II类抗原表达下调导致复发风险的同时增加了患者由T细胞抑制性配体上调导致复发的风险。后续一些移植中心采用地西他滨联合PD-1阻断剂结合治疗时，患者存活率有显著上升，这主要是地西他滨和PD-1阻断剂可以同时阻止肿瘤细胞的两种免疫逃逸方式，另外PD-1阻断剂可以很好的解决地西他滨上调T细胞抑制性配体这一副作用。

对于移植后复发，我们有多种的治疗手段，但不同的治疗手段其免疫原理不同，我们需要了解患者移植后复发的免疫学机理，采取针对性的治疗方法，才能起到事半功倍的效果。今天，我们介绍了患者移植后HLA单倍体丢失，HLA II类抗原表达下调，T细胞抑制性配体表达上调这三种常见的移植后免疫逃逸方式（这三种逃逸方式约占移植后复发方式的80%-90%），这三种复发中的治疗也存在明显区别。
HLA LOSS（HLA 单倍体丢失）
>基因组层面，不可逆；
>主要发生在半相合移植（30%）>无关供体移植>脐血移植；
>治疗：不要使用DLIs、选取与患者未丢失HLA单倍型错配的供体进行二次移植、CAR-T、双特异性抗体（BsAbs）有一定治疗效果。
HLA II类分子表达下调
>转录水平的，可逆（表观遗传学）；
>所有种类移植均存在，约40%；
>治疗：诱导IFN-γ分泌、去甲基化药物。
T细胞抑制性配体表达上调
>转录水平的，可逆（表观遗传学）；
>所有种类移植均存在（约20%~30%，常混合出现）；
>治疗：免疫检查点药物。
目前，博富瑞公司最新推出移植后复发方式相关检测，通过HLA LOSS检测、肿瘤细胞HLA II类抗原表达检测及肿瘤细胞PD-L1抗原表达检测，可以明确患者移植后复发的免疫学原理，给临床精准用药提供检测支持。

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